2 sonuçtan 1 ile 2 arası
  1. #1
    Lisans Üye okhan - ait Kullanıcı Resmi (Avatar)
    Üyelik tarihi
    22 Feb 07

    Mesajları
    417
    Konuları
    215
    Eklentileri
    70
    Kredisi
    3530
    Harcanan
    0
    Kalan
    3530

    Standart Anabolizan Madde Tayini (DES hormonu)

    Anabolik ajanlar sığır, koyun ve diğer evcil hayvanlarda büyümeyi arttıran ve canlı ağırlık artışına neden olan maddelerdir.

    1.0. AMAÇ VE KAPSAM

    Et ve et ürünlerinde; kompetatif enzim immunassay metodu ile kantitatif olarak DES hormonunun belirlenmesi amaçlanmıştır.

    2.0. UYGULAMA YÖNTEMLERİ

    2.1. Alet Ekipman Tanımları

    - 450 nm spektrofotometre
    - evaporatrör
    - ultra turrax
    - RIDA C18 kolon (R- Biopharm AG, R2002)
    - 1-20 µl, 50 µl- ,100 µl- , 200 µl- , 500 µl ve 1000 µl lik otomatik pipetler
    - Santrifüj edilebilir kapaklı tüpler
    - Soğutmalı santrifüj

    2.2. Kimyasal Maddeler

    - Methanol p.a
    - tert.-butylmethylether p.a.
    - petroleum ether
    - 6 M phosphoric acid
    - 1 N NaOH
    - 20 mM tris-HCl buffer ( pH 8.5)
    - 67 mM PBS buffer ( pH 7.2)
    - washing buffer: NaH2PO4 x H2O + Na2 HPO4 x 2 H2O + NaCl + Tween 20

    2.2.1. Kimyasal maddelerin hazırlanması

    - Methanol’ ün % 40’lık, % 70’lik ve % 80’lik olmak üzere üç ayrı konsantrasyonu hazırlanır.
    - tert.-butylmethylether p.a. direk olarak kullanılır.
    - washing buffer : 20 mM PBS buffer ( pH 7.2)
    0.55 g NaH2PO4 x H2O+ 2.85 g Na2 HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl + 1 ml Tween 20
    1000 ml distile suya tamamlanır. (bu buffer 2-8 oC’de bir hafta dayanıklıdır)
    - 67 mM PBS buffer ( pH 7.2):
    1.8 g NaH2PO4 x H2O+ 9.61 g Na2 HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl 1000 ml distile suya tamamlanır.
    - 20 mM tris-HCl-buffer, pH 8.5
    - methanol/tris-HCl (20/80 v/v): 2.42 g tris-(hydroxymethyl)-aminomethane alıp 700
    ml distile suda çözündürün + 200 ml % 100’lük methanol ilave edin, 5 M HCl ile
    pH’yı 8.5’e ayarlayın ve distile su ile 1000 ml’ye tamamlayın.

    2.3. Numunenin Hazırlanması:

    1. Et örneği parçalanır (parça et ise yağlı kısımları temizlendikten sonra)
    2. Bu parçalanmış numuneden 5 g cam bir kap içine alınarak 10 ml 67 mM PBS pH 7.2 ile 5 dakika çalkalanarak iyice homojenize edilir.
    3. Homojenize edilen bu örnekten 3 g santrifüj tüpüne alınır ve üzerine 8 ml tert.-butylmethylether ilave edilerek 20 dak iyice çalkalanır.
    4. Oda ısısında (20-25 oC) 10 dak 3000 g de santrifüj edilir.
    5. Eter süpernatantı başka bir tüpe alınır.
    6. Ekstraksiyon işlemi tekrar 8 ml tert.-butylmethyether eklenerek tekrarlanır.
    7. Eter fazları birleştirilir ve bu birleştirilen eter fazları kuruyuncaya kadar uçurulur.
    8. Kalıntıya 1 ml % 70’lik methanol ilave edilir ve iyice çalkalanarak çözündürülür.
    9. Metanolik solusyona 3 ml petroleum ether ilave edilir ve 15 saniye karıştırılarak homojenize edilir.
    10. Kısa süre santrifüj edilir ve petroleum ether supernatantı ayrılıp atılır.
    11. Metanolik solusyon uçurulur ve kalıntı 1 ml dichlormethane içinde çözündürülür ve 3 ml 1 N NaOH ile ekstrakte edilir.
    12. Bu ekstrakt 300 μl 6 M phosphoric acid ile nötralize edilir ve aşağıdaki şekilde RIDA C18 kolondan geçirilir
    13. RIDA C 18 kolondan % 100’lük metanolden 3 ml geçirilir,
    14. Daha sonra 2 ml methanol/20 mM tris-HCl (20/80 v/v) pH 8.5 geçirilir,
    15. Bu işlemden sonra 12. maddedeki hazırlanmış olan numune (yaklaşık 3.5 ml) kolondan sn de 1 damla akacak şekilde geçirilir.
    16. Kolondan tekrar 2 ml methanol/20 mM tris-HCl (20/80 v/v) pH 8.5 geçirilir
    17. Daha sonra 3 ml % 40’lık metanol geçirilir.
    18. Tüm sıvı içerik basınçla kolondan uzaklaştırılır ve 3 dak süre ile kolondan hava geçirilerek kurutulur. Bu tüp uzaklaştırılır ve kullanılmaz.
    19. Kolonun altına temiz bir tüp yerleştirilir. Kolonun üzerinden 1 ml % 80’lik metanol geçirilir. Tamamının geçtiğinden emin olun.
    20. Bu metanolik süzüntü 1:2 (1+1) oranında % 80’lik metanol ile dilüe edilir.
    21. Daha sonra bu solusyon 1:2 (1+1) oranında distile su ile dilüe edilir.
    22. Bu sıvının 20 ml si test için kullanılır.

    Not: %80’lik veya %40’lık metanol solusyonu içindeki elüeler -20 oC’de birkaç ay, buzdolabında 2 hafta saklanabilir.

    2.4. Reaktiflerin Hazırlanması:

    · Tüm reaktifler oda ısısına getirilir.
    · Kullanımdan sonra reaktifler hemen 2-8°C’ye kaldırılmalıdır.
    · Standartlar, substrat, kromojen ve stop solüsyonu kullanıma hazır haldedir.
    · DES enzim konjugatın hazırlanması:
    - Şişesi kırmızı kapaklıdır.
    - 1:11 oranında buffer ile dilue edilir (200 µl konjugat konsantre+ 2 ml buffer; 4 strip için yeterlidir)
    · Anti-DES antibody hazırlanması:
    - Şişesi siyah kapaklıdır.
    - 1:11 oranında buffer ile dilue edilir (200 µl antibody konsantre+ 2 ml buffer; 4 strip için yeterlidir)


    •    Alt 06-02-2007'den beri

      Advertising

      advertising
      Mesajları
      1
      Konuları
      0
      Eklentileri
      0

        
       

  2. #2
    Lisans Üye okhan - ait Kullanıcı Resmi (Avatar)
    Üyelik tarihi
    22 Feb 07

    Mesajları
    417
    Konuları
    215
    Eklentileri
    70
    Kredisi
    3530
    Harcanan
    0
    Kalan
    3530

    Standart Cevap: Anabolizan Madde Tayini (DES hormonu)

    3.0 Testin yapılışı:

    - Standartlar kullanıma hazır haldedir. İlk 6 kuyucuğa sırayla standartlardan 20 µl pipetlenir.
    - 7. kuyucuktan itibaren hazırlanan numunelerden 20 µl pipetlenir.
    - Tüm kuyucukların üzerine 50 µl dilüe edilmiş anti-DES antibody ilave edilir.
    - Hafifçe karıştırılarak bir gece oda ısısında (20-25 oC) inkube edilir.

    Not: Test prosedürüne devam etmeden önce kit reaktifleri en az yarım saat süreyle oda ısısına (20-25 oC) getirilmelidir.

    - Kuyucuklar 3 defa washing buffer ile yıkanır.
    - Tüm kuyucukların üzerlerine 50 µl dilüe edilmiş enzim konjugat pipetlenir. Plate hafifçe çalkalanır ve üzeri alimünyum folyo ile kapatılarak 1 saat oda ısısında (20-25 oC) inkubasyona bırakılır.
    - İnkubasyon süresi sonunda kuyucuklar 3 defa washing buffer ile yıkanır.
    - Kuyucuklar ters çevrilerek kurutma kağıdı üzerinde suyu alınır.
    - Tüm kuyucukların üzerine 50 µl substrat ve 50 µl kromojen pipetlenir. Hafifçe karıştırılır ve alüminyum folyo ile kapatılarak 30 dakika oda ısısında (20-25 oC) karanlıkta inkube edilir.
    - Bu süre sonunda 100 µl stop solüsyonu pipetlenir.

    4.0 Hesaplama:

    - 450 nm de okutulur.
    - Sonuçlar bilgisayara girilerek hesaplanır.
    - Yukardaki hazırlanış şekline göre et numunelerinde dilüsyon faktörü 4 dür.

Advertising

Advertising

Benzer Konular

  1. sularda organik madde tayini
    Kimyasal Analizler forum içinde, yazan buyuksahin
    Yorum: 3
    Son Mesaj: 07-11-2009, 19:09
  2. Anabolizan Madde Tayini (17β-ÖSTRADİOL)
    Mikrobiyoloji ve Toksikoloji forum içinde, yazan okhan
    Yorum: 0
    Son Mesaj: 09-10-2008, 16:47
  3. çayda kuru madde miktarı tayini
    Kimyasal Analizler forum içinde, yazan as0101
    Yorum: 0
    Son Mesaj: 23-03-2008, 00:10
  4. Bitkisel Sıvı Yağlarda ve Zeytinyağında Uçucu Madde Tayini
    Kimyasal Analizler forum içinde, yazan Gülsel ŞEN
    Yorum: 0
    Son Mesaj: 19-10-2007, 15:10
  5. İş Güvenliği Tüzüğü Madde:18
    OHSAS 18001 forum içinde, yazan sokol500
    Yorum: 4
    Son Mesaj: 01-07-2007, 12:13

Bu Konudaki Etiketler

Yer imleri

Yetkileriniz

  • Konu Acma Yetkiniz Yok
  • Cevap Yazma Yetkiniz Yok
  • Eklenti Yükleme Yetkiniz Yok
  • Mesajınızı Değiştirme Yetkiniz Yok
  •  


HAKKIMIZDA

    GIDA GÜNDEMİ 2007 YILINDA FORUMFOOD.NET İSMİ İLE YOLA ÇIKMIŞ, BUGÜN 150 000 İN ÜZERİNDE ZİYARETÇİ SAYISI İLE SEKTÖRE HİZMET ETMEKTEDİR.

TAKİP EDİN

Twitter Facebook youtube Flickr RSS Feed