T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ









MİKROORGANİZMALARLA GENETİK MADDE AKTARIMI (GEN TRANSFERİ)



(Biyoteknoji 1. Vize Çalışması)










HAZIRLAYAN











Nisan, 2006
DENİZLİ


İÇİNDEKİLER




************************************************** ************************************************** ************************ Sayfa********************************************* ************************************************** *************************
İÇİNDEKİLER I

ŞEKİL LİSTESİ II

1. GİRİŞ 1

2. MİKROORGANİZMALARLA GENETİK MADDE
AKTARIMI (GEN TRANSFERİ) 2

2.1. Transformasyon 2

2.2. Konjugasyon 6

2.2.1. F+ hücre** F- hücre konjugasyonu 10

2.2.2. Hfr hücre** F- hücre konjugasyonu 11

2.2.3. F’ hücre** F- hücre konjugasyonu 13

2.3. Transdüksiyon 14

2.3.1. Generalize transdüksiyon 15

2.3.2. Özel transdüksiyon 17

2.3.3. Abortif transdüksiyon 18

3. KAYNAKLAR 21

ŞEKİL LİSTESİ




************ Sayfa

Şekil 2.1.1 Transformasyonun genel şeması. 3

Şekil 2.1.2 Yabancı DNA’nın bakteri hücresine transformasyonunun
Basamakları. Hücre içine giren iki iplikli DNA’dan sadece
bir iplik transforme olur, hücre bölünmesi ile de yavru
hücreye geçer. 5

Şekil 2.2.1 Konjugasyonun genel şeması. 7

Şekil 2.2.2********** Davis’in U Tüp deneyi. 8

Şekil 2.2.3********** Maya hücrelerinde protoplast füzyonu. 9

Şekil 2.2.1.1 F+** F- çaprazlaması sonucu F- hücrelerin F+ haline dönüşmesi
Görülmektedir. Konjugasyon sırasında F faktör alıcı hücreye
Aktarılırken aynı zamanda replike ve oluşan yeni kopyası alıcı
hücreyi F+’ya dönüştürmektedir. Replikasyon esnasında saat
yönünde dönüşü takip etmek için siyah bir çizgi F faktörüne
eklenmiştir. 11

Şekil 2.2.2.1********F+ hücresinin Hfr’ye dönüşümü ve Hfr** F-**hücre çaprazlaması. 12

Şekil 2.2.3.1********Hfr hücresinin F’ haline dönüşümü ve F’** F- hücre çaprazlaması. 14

Şekil 2.3.1.1********Genel transdüksiyon.****** 16

Şekil 2.3.2.1********E.coli’nin kromozomuyla λ fajı DNA’sının birleşimi ve ayrılması. 18

Şekil 2.3.3.1********Abortif transdüksiyon.**** 19
************************************************** ************************************************** **********************************



1. GİRİŞ

Bakterilerde genetik materyalin küçük veya büyük bir bölümü bir bakteriden diğerine çeşitli mekanizmalar aracılığı ila aktarılıp, sonunda önemli genetik değişiklikler oluşabilmektedir. Verici bakteriden alıcı bakteri hücresine, bakteri genomunun aktarılması sonucu her iki bakteri hücresinin genetik özelliklerini birlikte içeren melez bakteriler meydana gelirler. Bakterilerde görülen bu olaylar sırasında, yüksek canlılarda olduğundan farklı olarak, iki hücrenin çekirdeklerinin tümü birleşmemekte, alıcı bakterinin kromozomu yalnız belli bir bölüm için diploid (benzer genlerden çift dizi taşınması) duruma geçmektedir. Kısmi bir zigot olarak da nitelendirilen melez bakteride, verici hücreden alınan genetik materyale ekzogenot, bunun alıcı hücredeki karşılığına ise endogenot denir. Alıcı bakteri DNA’sının replikasyonu sırasında, ekzogenot da replike olur ve aralarında meydana gelen çaprazlaşmalar sonucu, alıcının DNA’sına vericiden gelen ekzogenot eklenir. Bu bakteriden oluşacak yavru bakteriler, alıcı hücrenin genomuna taşırlar. Verici bakteriden aktarılan bir DNA segmentinin alıcının genomuna girip, alıcı bakteriye birtakım yeni özellikler kazandırması mümkündür. Böylece meydana gelen olaya rekombinasyon (yeni bileşim), oluşan melez bakteriye rekombinant (yeni bileşen) adı verilir (KILIÇTURGAY, GÖKIRMAK, TÖRE, GÖRAL ve HELVACI, 1992).













2. MİKROORGANİZMALARLA GENETİK MADDE AKTARIMI (GEN TRANSFERİ)


******Mikroorganizmalarda gen transferi üç ana mekanizma ile meydana gelmektedir. Bunlar;
1. Transformasyon,
2. Konjugasyon,
3. Transdüksiyon ’dur.


2.1. Transformasyon
Ortamda ikinci bir canlı hücre veya bakteriofaj bulunmaksızın, verici hücre tarafından ortama bırakılmış DNA’nın alıcı hücre tarafından kullanılarak, yeni bir hücre oluşmasıdır. Verici bakterinin DNA’sı ortama, genellikle bakterinin kendiliğinden parçalanıp erimesi veya bazı kimyasal maddeler aracılığı ile ekstraksiyonu sonucu salınır. Bu genetik materyalin alıcı hücre tarafından alınabilmesi için, deoksiribonükleaz enzimin etkisinden korunmuş olması ve alıcı hücrenin DNA moleküllerini hücre içine alabilecek yeteneğinin bulunması gerekir (AKMAN, 1983).
Bir mikroorganizma, kendisine DNA kompozisyonu yönünden çok yakın olan, diğer bir mikroorganizmaya ait genetik materyal içeren bir ortamda üretilirse, belli bir süre sonra, bu sıvı ortamdan katı besi yerine ekimler yapılırsa, bazı kolonilerin değişik morfolojide olduğu ve bunların, genetik materyali veren ölü mikroorganizma kolonilerine benzediği görülür. Örneğin (şekil 2.1.1’de), Diplococcus pneumoniae’nin II-R suşu, kendisini oluşturan öldürülmüş II-S suşunun DNA materyalini ihtiva eden uygun bir sıvı ortamda ve uygun bir süre temasa bırakıldıktan sonra, katı besi yerine yapılan ekimlerde bazı kolonilerin II-S karakterinde olduğu görülür. Bu denemede, II-S suşu öldürülmüş ve elde edilen DNA ekstraktları ortama katılmıştır. Canlı olan II-R suşu ortamda bulunan II-S suşuna ait bazı genetik materyalleri almış ve bu elementlerde taşınan karakterler yönünden pozitif hale (II-S haline) gelmiştir (ÇON, 2006).******************************************** ********************************
** Bu in vitro transformasyon Griffith’in yaptığı gibi in vivo olarak da yapılabilir. Griffith’in üzerinde çalıştığı tür D. pnemoniae’dır. Bu türün birçok strainleri mevcuttur. Griffith’in yaptığı deney şöyledir; tip II denilen strain ( canlı, kapsülsüz, avirulan, R formunda ) hücreleri ile tip II –S denilen ( kapsüllü, virulan, S formunda**)**strainin ısı ile öldürülmüş hücrelerini birbirine karıştırdıktan sonra fareler şırınga etmiş ve onların ölmelerini beklemezken hastalanarak öldüklerini görmüştür. Daha sonra Avery ve arkadaşları bu olayda kapsül yapımı ile ilgili olan ve ölü hücrelerden canlıya aktarılan maddenin DNA olduğunu saptamışlardır (M.ÖNER, 1996).
Bu iki (in vivo ve in vitro) denemede, ortak olan nokta, verici hücre (bakteri) DNA parçacıklarının alıcı hücre (bakteri) kromozomu ile birleşmiş olması ve verici hücreye ait karakterleri yönünden alıcıda pozitifliğin elde edilmesidir. Her iki hücrenin de antijenik yakınlığının çok fazla olması (birbirinden mutasyon ile türemiş olmaları) gen alışını kolaylaştırmaktadır. Antijenik yakınlığı olmayan bakteriler arasında transformasyon, genellikle, nadirdir (ARDA, 2000).




Şekil 2.1.1 Transformasyonun genel şeması (ARDA, 2000).


**

Transformasyon bakterilerde genetik rekombinasyona neden olan bir değişimdir. Transformasyon işlemi (şekil2.1.2’de), iki ana kategoriye ayrılan çeşitli basamaklardan oluşur: (1) alıcı hücreye DNA’nın girişi ve (2) alıcı kromozomdaki homolog bölge ile verici DNA’nın rekombinasyonu. Hücre popülasyonları içinde uygun fiziksel durumda hazır olan yani kompetent (uyumlu) hücreler DNA’yı içine alabilir. DNA’nın girişi, bakteri hücresinin yüzeyindeki sınırlı sayıdaki reseptör yerlerinden gerçekleşir. Bakteri hücre duvarı ve membranındaki bu geçiş için özel iletim molekülleri ve enerjiye ihtiyaç duyarlar. Alıcı hücrenin enerji üretimini ve protein sentezini baskılayan maddelerin transformasyonuda baskılaması bu fikri desteklemektedir. Giriş esnasında DNA molekülünün bir ipliği nükleazlarla kesilir ve sadece tek ipliğin transformasyonu gerçekleşir (2. ve 3. basamak). Transformasyona uğrayan DNA ipliği bakteri kromozomundaki komplementer bölgesi ile karşı karşıya gelir. Birkaç enzim aracılığı ile DNA parçası kromozomdaki homolog bölge ile yer değiştirir ve bu kromozom kısmı çıkarılarak parçalanır (4. basamak). Rekombinasyonun gözlenebilmesi için, aktarılacak DNA, genetik değişiklik taşıyan farklı bir bakteri suşundan alınmalıdır. Kromozoma yabancı DNA katıldıktan sonra oluşan rekombinant bakteriyel DNA yapısında, kromozamal DNA’ya ait bir DNA ipliği ve diğer iplikte ise transfer edilen DNA parçası taşınır. Bu iplikler genetik olarak birbirinin aynı olmadığı için sarmal bölge heterodubleks olarak isimlendirilir. Replikasyondan sonra bir kromozom, alıcı hücreninki ile aynı orjinal durumunu muhafaza eder, diğeri ise transforme olmuş gen taşır. Hücre bölünmesi ile bir konakçı hücre ve birde transforme olmuş hücre oluşur (C.ÖNER, 2002).



Şekil 2.1.2 Yabancı DNA’nın bakteri hücresine transformasyonun basamakları. Hücre içine giren iki iplikli DNA’dan sadece bir iplik transforme olur, hücre bölünmesi ile de yavru hücreye geçer (C.ÖNER, 2002).


Bir DNA segmentinin, diğer bir bakteri kromozomu ile birleşebilmesi için, her ikisinde de baz sıraları bakımından bir homologluğun olması şarttır. Transformasyonda, alıcı verici hücrelerin DNA’larının homolog oluşları yanı sıra bazı önemli faktörlerinde etkisi bulunmaktadır. Uygun ortam ve optimum koşullarda, üreyen hücrelerden ancak 10-7-10-8 kadarının, DNA segmenti alma yeteneği vardır. Bu nedenle üreme sırasında bazı hücrelerin belli bir fizyolojik duruma ulaşmasının ve DNA parçasını alabilecek kabiliyete kavuşmasının da önemi fazladır. Diğer bir deyime alıcı hücrenin diğerlerinden farklı ve kompetent olması gereklidir. Diğer önemli noktalardan biri de, DNA segmentlerinin,**0,3–8** 105 dalton molekül ağırlığından aşağı olmaması durumudur. Çift iplikçikli olmayan ve yukarıda bildirilen ölçülerden küçük olanlar alıcı hücrelere kolayca giremezler (ARDA, 2000).
D. pneumoniae 'den başka H. influenzae, Streptococcus sanguis, Niesseria gonorrhoeae, bitki patojenleri, Bacillus subtilis, nitrojeni fikse eden mikroorganizmalar arasında da, transformasyon tespit edilmiştir (KILIÇTURGAY, GÖKIRMAK, TÖRE, GÖRAL ve HELVACI, 1992).
Enterobakteriler arasında transformasyon pek başarılı olmamakla beraber, son yıllarda, yüksek kalsiyum iyonları konsantrasyonlarında E. coli 'de de transformasyon saptanmış olduğu bildirilmektedir (ARDA, 2000).
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, insan hücrelerinin de bu yeteneği taşıdığını göstermiştir. Bu araştırmada anarmol hemoglobin üreten bir kişinin göğüs kemiğinin (sternumun) kırmızı iliğinden alınan olgunlaşmamış kırmızı kan hücrelerinin doku kültüründe üretilebileceği ispatlanmıştır. Normal bir insanın göğüs kemiğindeki ilkten alınan hücrelerden hazırlanmış bir besin ortamında üretilen bu hücreler bir zaman sonra normal hemoglobin yapabilme yeteneği kazanmıştır. Daha sonraki aşamalarda hücreler (eskiden anarmol, yeni durumda normal hemoglobin üreten) alındığı kişinin sternumunun içerisine enjekte edilerek, o kişinin normal hemoglobin üretimi sağlanabilmiştir (DEMİRSOY).


2.2. Konjugasyon
Bir bakteriye ait genetik maddenin (DNA’nın), aynı cins içinde bulunan veya aynı türden diğer mikroorganizmaya direkt temas veya seks pilusları aracılığı ile transfer edilmesine konjugasyon denir (ÇON, 2006).
Bakterilerde konjugasyon olgusunu aydınlatan ilk çalışmalar1946 yılında Lederberg ve Tatum’um araştırmalarından kaynaklanmaktadır. Bu iki araştırmacı organizma olarak E. coli K–12 olarak bilinen straini seçmişlerdir. Bu bakteri minimal agar olarak bilinen ve içinde sadece bir karbonhidrat, su ve mineral maddeler içeren bir ortamda büyüyebilme kapasitesine sahip prototrof bir bakteridir (M.ÖNER, 1996).
Bu araştırmacılar bu bakterinin thr+, leu+,bio+,met+, thi+ olduğunu, yani bu bakteri strainin threonin, leucin, biotin,**metionin ve tiamin genotipli hücrelere sahip olduklarını ve bu hücrelerinin minimal agarda büyüme kapasitesine sahip olduğunu gösterdikten sonra bunları röntgen ışınları altında belirli bir süre tutmuşlar ve iki mutant suşu ayrı ayrı izole etmişlerdir. Bu mutantlardan birisi (B suşu) bio+,met+,thi-, thr- ve leu- ötekisinin ise (A suşu) bio-, met-, thr+,thi+ ve leu+ olduğu saptanmış. Bunlardan (şekil 2.2.1’de) B suşu içinde kendi sentezleyemediği threonin, tiamin ve leucin içeren, ötekisi ise kendi sentezleyemediği biotin ve metionin içeren ortamlarda ayrı ayrı kültüre alınmışlardır. Bundan sonra bu ikili mutantlardan her biri ayrı ayrı minimal agar plaklarına uygun bir sayıda ekildiklerinde her ikisinin de üreyemedikleri öte yandan bu iki ayrı tip hücre karıştırılarak minimal agar plaklarına ekildiklerinde prototrof koloninin oluştuğunu görmüşler ve bunu karıştırılan iki strain arasında genetik bir alışverişin cereyan ettiğine hükmetmişlerdir. Ancak bu olgu 10-7 kadardır (C.ÖNER, 2002).




Şekil 2.2.1 Konjugasyonun genel şeması (C.ÖNER, 2002).


Lederberg ve Tatum’un buluşları konjugasyonun genetik temeli üzerine başka çalışmaların yapılmasını teşvik etmiştir. Kromozomunun bir bölümünü aktaran hücreye F+ hücreleri denmiştir. Alıcı bakteri, vericiden gelen bir kısım kromozom materyalini alır, kendi kromozomu ile birleştirir bu hücrelere de F- hücreleri denmiştir.1950 yılında Bernard Davis kromozom aktarımı için doğrudan hücre teması gereklidir fikrini desteklemek için U tüpü yöntemini (şekil 2.2.2’de) geliştirmiştir. Tüpün taban kısmında sıvı besiyerinin geçebileceği fakat bakterilerin geçemeyeceği gözeneklere sahip cam filtre vardır. F+ hücreleri filtrenin bir tarafına, F- ise fitrenin diğer tarafına yerleştirilir. Besiyeri filtrenin iki tarafın gire çıkar, bu nedenle bakteriler inkübasyon boyunca aynı besiyerini kullanırlar. Tüpün iki tarafındaki örnekler bağımsız olarak minimal besiyerine ekildikleri zaman hiçbir prototrofa rastlanmamıştır. Davis bu deneye dayanarak, genetik rekombinasyonun gerçekleşebilmesi için fiziksel temasın gerekli olduğu sonucuna varmıştır (C.ÖNER, 2002).




Şekil 2.2.2 Davis’in U Tüp deneyi (C.ÖNER, 2002).


Kısa sürede farklı bakteri suşlarının da genetik materyalin tek yönlü transferini gerçekleştirdikleri ortaya çıkarılmıştır. Protoplast füzyon (şekil 2.2.3’de) tekniği de (bakteri, basil, streptomyces, maya, bitki, vs.) gen aktarımı için kullanılmaktadır. İki ayrı türe ait protoplastlar elde edildikten sonra, bunlar, PEG'li ortamda direkt temasa getirilirler. Uygun bir süre ve ısıda tutulan protoplastlar arasında birleşme ve gen aktarmaları kolayca olabilmektedir (ARDA, 2000).




Şekil 2.2.3 Maya hücrelerinde protoplast füzyonu.


Konjugasyon fenomeninde, verici durumda olma kabiliyetini, genellikle, hücrede bulunan ve nakledilebilir bir genetik element olan plazmidler tayin ederler. Bu plazmide fertilite faktörü (F-faktörü veya seks faktörü) adı verilir. Bu faktörü alan hücreler taşınan karakterler yönünden pozitif hale gelirler. Aktarma olayı 10-5-10-6 oranında meydana gelmektedir. İki hücre arasında konjugasyonun gerçekleşebilmesi için, bunların birbirleriyle temasa gelmesi gerekir. Bu olguyu, direkt temas kadar, genellikle, verici hücrelerdeki seks pilusları da yaparlar. Seks piluslarının sentezlenmesini hücre içinde bulunan seks faktöründeki özel genler sağlarlar. Bunlar, diğer**normal piluslardan (fimbria) daha uzun ve kalındırlar. Ortaları boş olduğundan bir boru ve geçit köprüsü görevini yaparlar. Genetik materyal buradan geçerek alıcıya aktarılır. Normal pilusların gen aktarmasında rolleri yoktur. F plazmidi ile başlıca 3 tür konjugasyon oluşabilmektedir. Bunlar da;
2.2.1. F+ hücre x F- hücre konjugasyonu
F faktörünü sitoplazmasında taşıyan bir F+ hücre ile buna sahip olmayan F- hücre arasında gerçekleşen F faktörü aktarılmasında seks pilusu önemli fonksiyona sahiptir. Ancak, böyle iki hücrenin direkt teması da genetik madde aktarımına yardımcı olabilmektedir. F+ hücre x F¯ hücre birleşmelerinde genin aktarımı tek yönlüdür. Yani vericiden alıcıya doğrudur. İki yönlü olmamaktadır. Ayrıca, F+ hücre ile F- hücre birleşmelerinde de alıcı hücre her zaman F+ hücre şekline dönüşmeyebilir. Konjugasyon sırasında, F faktörünün bir iplikçiğinde oluşan kopma (ori T bölgesi) ve buradan ayrılan 5' ucu, seks pilusunun oluşturduğu köprüden geçerek F- hücreye transfer edilir. Aktarılan tek iplikçiğin karşısında 5'  3' yönünde ikinci bir iplikçik sentezlenerek alıcı hücrede çift iplikçikli ve sonra da sirküler forma dönüştürülür. Böylece başlangıçta F- olan alıcı hücre F+ hale dönüşmüş olur. Vericide bulunan tek kopya da rolling circle replicationla çift iplikçikli forma getirilir. Böylece verici hücre de yine plazmid kalmış ve bu hücre F+ karakterini korumuş olur.
Alıcı hücreye aktarılan F plazmidi, burada sitoplazmada kalır. Nadiren bakterinin genomuna da integre olabilir ve hücreyi Hfr haline getirebilir veya bazen de hücreden ayrılabilir (ARDA, 2000).



Şekil 2.2.1.1 F+** F- çaprazlaması sonucu F- hücrelerin F+ haline dönüşmesi görülmektedir. Konjugasyon sırasında F faktör alıcı hücreye aktarılırken aynı zamanda replike ve oluşan yeni koyası alıcı hücreyi F+ dönüştürmektedir. Replikasyon esnasında saat yönünde dönüşü takip etmek için siyah bir çizgi F faktöre eklenmiştir (C.ÖNER, 2002).


2.2.2. Hfr hücre x F-hücre konjugasyonu
1950 yılında Cavalli-Sforza, E.coli’nin F+ suşlarını, mutasyonu uyardığı bilinen bir kimyasal olan azot mustard ile muamele etmiştir. Bu madde ile muamele edilen verici hücrelerden 10-4 oranında rekombinasyona uğrayan verici bakteri suşları elde edilmiştir. Bu oran orijinal F+ suşlarında görülen sıklıktan 1000 kat daha fazladır.1953 yılında William Hayes buna benzer oranda yüksek rekombinasyona sahip başka bir suş yalıtmıştır. Her iki suş da Hfr veya yüksek sıklıkta rekombinasyon yapabilen şeklinde isimlendirilmiştir (C.ÖNER, 2002).
Sirküler olan F faktörünün, alıcı hücre kromozomu ile birleşebilmesi için birbirlerinde homolog bölgelerin bulunması gereklidir. Birleşmeden önce sirküler olan F faktörü bakteri kromozomu üzerindeki homolog bölge yanına gelir. Birleşme homolog bölgeler arasında tek bir krosoverle gerçekleştirilir. Böylece, Hfr hücreler meydana gelirler. E. coli 'nin kromozomu üzerinde F- faktörü için homolog olan birçok bölge (8–10 kadar) bulunmaktadır. F faktörü bu bölgelerin bir tanesi ile integre olur. Hfr hücre oluştuktan sonra, bu faktör hücreyi seks pilusu oluşumu için tembih eder ve sentez mekanizmasını aktive eder (ARDA, 2000).


**

Şekil 2.2.2.1 F+ hücresinin Hfr’ye dönüşümü ve Hfr** F-**hücre çaprazlaması (C.ÖNER, 2002).


Aktarma sırasında Hfr hücrelerde, F faktörü, hücre DNA'sı ile birleşmiş olduğu yerden kopmakta ve bu faktör bakteri kromozomunun arka ucunda kalmaktadır. Bu durum, konakçı DNA'sının aktarılmasında itici bir güç yaratmaktadır. Sonda bulunması nedeniyle, eğer yeterli süre tanınmazsa veya kültürler çalkalanırsa, F faktörü alıcı hücreye aktarılamaz. Bu nedenle, Hfr x F- hücre birleşmelerinde genellikle F- hücreler elde edilir. Buna karşılık F+ x F- hücre birleşmesinde F+ hücreler daha fazladır. Halbuki Hfr hücreler, F+'lere oranla, 1000 defa daha fazla konjugasyon yapma yeteneğine sahiptirler. Hfr hücrelerden F+ faktörü alıcıya az oranda geçmesine karşın, donör DNA segmentinin geçme olanağı çok fazla olduğundan, gen aktarması yüksek sıklıkta gerçekleşebilmektedir (ARDA, 2000).
2.2.3. F' hücre x F- hücre konjugasyonu
1959 yılında, Edward Adelberg, E.coli’nin Hfr suşları ile yaptığı deneyler esnasında, kromozoma katılmış olan F faktörünün serbest kalabileceğini ve hücrenin F+ durumuna geri dönebileceğini keşfetmiştir. F faktörü bazen bütünleşmiş olduğu bakteri DNA’sından ayrılarak, kromozom dışında çembersel bir şekilde devamlılığını sürdürebilir. Böylece Hfr bakterisinden F+ bakteri meydana gelmiş olur. Bu ayrılma sırasında, F faktörüne ait genlerle birlikte kromozomal DNA segmentleri de bakteri DNA’sından kopabilmektedir. Yani plazmid niteliğindeki bu oluşumda hem F faktörüne, hem de bakteri kromozomuna ait birtakım genler bir arada bulunurlar. Sitoplazmada serbest halde bulunan bu melez genoma F’ faktörü, F’ faktörüne sahip olan bakterilere de F prime (F’) hücresi adı verilmektedir. F' faktörünü taşıyan hücreler (F' prime), eğer çok önemli biyokimyasal olayları idare eden genleri kaybetmişse hücrenin ölümüne neden olabilir.**
Konjugasyon Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Serratia, Vibrio, Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Providencia gibi pek çok enterik bakteri cinsine ait türler arasında, hatta değişik cinsler (Shigella-Escherichia, E.coli-V.cholerea) arasında oluşabilen bir rekombinasyondur. Genellikle bir arada yaşayan bakteriler (özellikle barsak bakterileri) arasında gerçekleşen bu tip rekombinasyon sonunda, oluşan melez bakteriler gerek tanı gerekse tedavi yönünden ciddi sorunlar yaratabilmektedirler. (KILIÇTURGAY, GÖKIRMAK, TÖRE, GÖRAL ve HELVACI, 1992).



Şekil 2.2.3.1 Hfr hücresinin F’ haline dönüşümü ve F’** F- hücre çaprazlaması (C.ÖNER, 2002).


2.3. Transdüksiyon
1952 yılında Zinder ve Lederberg Salmonella typhimurianum türü üzerinde cinsel birleşme üzerinde bir araştırma yaparken bir bakteriye ait kromozom parçalarının bir bakteriofaj aracılığı ile diğer bakteriye taşındığını ve hücrenin yaşamını sürdürebilmesi halinde, aktarılan kalıtsal materyalin yeni hücrenin mevcut kalıtsal materyali ile yeni bir düzene girerek ona yeni bir özellik kazandırdığını görmüşler ve bizim bugün transdüksiyon dediğimiz olayı bulmuşlardır. Buna göre transdüksiyonu bir bakteriye ait kalıtsal materyal parçacıklarının bir bakteriofaj aracılığı ile diğer bir bakteriye taşınması olarak tanımlayabiliriz (M.ÖNER, 1996).
Transdüksiyonda kalıtsal madde aktarımı bir bakteriofaj aracılığı ile olmakta ve kalıtsal maddeyi kabul eden hücre bakteriofaj etkisinden kendisinden kurtarabildiği yani canlı kalabildiği takdirde kalıcı özellikler kazanabilmektedir.
Fajlar, bakterileri parçalayan veya lize eden virüslerdir (bakteriofaj). Konakçıya özel olduklarından, bakteri fajları arasında da tür spesifitesi vardır. Bazı fajların genomu, konakçı hücresine girdikten sonra orada replike olur ve bakteriyi parçalar (virulent veya vegetatif fajlar). Bir kısmı ise, infekte ettiği hücreyi lize etmeyebilir (temperate fajlar). Böyle fajlardan bazıları sitoplazmada kalır veya bazıları da konakçı DNA'sı ile birleşebilir. Böylece onun bir devamı haline gelebilir (profaj). İçerisinde profaj halinde bakteriofaj bulunduran lizojenik hücreler, ultraviole ışınlarına maruz bırakılırsa, profaj aktive olur ve konakçısını lize edebilir. Profajlar, yerleştikleri konakçı DNA'sından bir veya birkaç gen içeren bir segment parçasını alabilir ve bunu, adsorbe olduğu başka alıcı hücreye aktarabilir.
Transdüksiyon suretiyle gen aktarılma olayına Gram negatif (Salmonella, E. coli, Shigella, Proteus, Vibrio, P. aeruginosa, vs.) ve Gram pozitif mikroorganizmalarda (Stafilokok ve basiller) rastlanılmıştır (ARDA, 2000).
Transdüksiyon başlıca üç tarzda gerçekleştirilebilmektedir. Bunlar da;
1. Generalize Transdüksiyon,
2. Özel Transdüksiyon,
3. Abortif Transdüksiyon’dur.
2.3.1. Generalize transdüksiyon
Bir bakteri hücresi içinde faj gelişirken, parçalanan konakçı DNA’sının herhangi bir segmenti, aynı yerde sentezlenen faj başlığı içinde kalabilir. Böylece faj olgunlaştığında faj başlığı içinde, kendi genomu yanı sıra içinde ürediği bakterinin genetik materyali bulunan fajlar oluşur. Aynı anda normal fajlarda olgunlaşıp, bakteriyi eriteceklerinden, içinde bakteri DNA’sı bulunan fajlar dış ortama çıkarlar. Fajlarda adsorbsiyon ve DNA’yı bakteriye aktarma özelliği protein yapı ile ilişkili olduğu için, içinde bakteri DNA’sı bulunan faj partikülleri de özgül oldukları bakteri hücresine yapışıp, genomunu bu yeni bakteriye aktarabilirler. Böylece bakteri içine giren verici bakterinin DNA segmenti, alıcı bakterinin DNA’sının homolog bölgesi ile çaprazlaşıp, bu bölgede kendi allelinin yerine geçer ve alıcı bakterinin vericinin bazı özelliklerini kazanmasına neden olur (KILIÇTURGAY, GÖKIRMAK, TÖRE, GÖRAL ve HELVACI, 1992).
Generalize transdüksiyonda, bu görevi yapan fajlar, konakçı DNA'sının herhangi bir geninin veya belli bir segmentinin yanına yapışmazlar. Konakçı DNA parçalandığı zaman hücre içinde dağınık bir halde bulunan DNA parçacıklarından herhangi birinin, faj kapsidi içine tesadüfen girmesi ve içinde kalması sonu bu tarzda aktarılma şansına sahip olabilmektedirler. Bu nedenle her bakteri DNA segmentinin veya bunun üzerinde bulunan özel karakterlerin (genlerin) taşınma veya alınma olasılığı bütün genler için eşit olmaktadır. Bu tür transdüksiyon yapan fajlar arasında E.coli K-12’nin P1 fajı, Salmonella’larda PLT 22 fajı, B. subtilis 'te bulunan SPIO ve PB 51 fajları sayılabilir (ARDA, 2000).




Şekil 2.3.1.1 Genel transdüksiyon (C.ÖNER, 2002).

2.3.2. Özel transdüksiyon
Transdüksiyon yapan faj,**içimde bulunduğu konakçı DNA’sının belli bir yerine yerleşir ve hücre DNA’sı ile birleşerek profaj haline gelir. Bu tipte transdüksiyon yapabilen fajların en iyi bilineni E.coli’nin lambda (λ) fajıdır. Bu nedenle bu tip transdüksiyona λ fajı tipi transdüksiyon da denmektedir (KILIÇTURGAY, GÖKIRMAK, TÖRE, GÖRAL ve HELVACI, 1992).
Lambda, fajı, E. coli 'de genellikle biotin ile galaktoz geninin arasına girer ve burada profaj olarak bulunur [şekil 2.3.2.1(a)’da]. Bakteri kromozomuna entegre olan faj λ DNA’sı zamanla buradan ayrılır, çoğalır ve konakçı hücreyi lize eder. Bazen ayrılma doğru yapılmaz ve E.coli’nin galaktoz genini de (gal+) beraberinde götürür [şekil 2.3.2.1(b)’de]. Eğer, bu faj, gal- bir mikroorganizmayı infekte ederse, bunu gal+ haline sokar (C.ÖNER, 2002).
Bazı durumlarda, profaj, konakçı hücresinden ayrılırken ve konakçı DNA'sından bir segment alırken buna karşılık kendi DNA'sından da bir kısmını, konakçı DNA’sı üzerinde bırakabilir. Böylece DNA'sında eksik genler bulunan faj, bu durumuyla başka bir bakteriyi infekte ettiğinde, bu alıcı hücre içinde eksik genlerin oluşturacağı veya sentezlediği önemli ürünleri bulamazsa ve bu bakteri de, eğer bu ürünleri sentezleyecek bilgilere haiz başka bir fajla infekte olmazsa, eksik olan faj genomu replike olamaz ve olgunlaşamaz. Buna sınırlı transdüksiyon denir.
Konakçı hücrenin kromozomu ile birleşmiş bulunan faj, konakçı hücre UV ışınlarına maruz bırakılırsa, aktive olur ve DNA'dan veya yerleştiği yerden ayrılarak konakçısını lize ederler. DNA'dan ayrılırken, yanında bulunduğu veya yanına yapıştığı bakteriye ait geni de birlikte alarak ayrılırlar. Böyle bir faj başka bir bakteri kültürüne inokule edilirse buradaki hücreleri infekte ettiğinde bu taşıdığı geni o bakteriye aktarır ve bakteriyi, gende bulunan özel karakterler yönünden, pozitif hale getirir (ARDA, 2000).




Şekil 2.3.2.1 E.coli’nin kromozomuyla λ fajı DNA’sının birleşimi ve ayrılması**(C.ÖNER, 2002).


2.3.3. Abortif transdüksiyon
Fajlar tarafından, konakçısından alınan ve bazı karakterleri (genleri) taşıyan DNA segmenti, faj başka hücreyi infekte ettiğinde, bu hücreye aktarılır. Ancak, bu DNA parçası hücre içinde kalır, bakteri DNA'sı ile birleşmez. Bağımsız olarak hücre içinde bulunmasına karşın, hücre DNA'sı ile eş zamanda replike olma kabiliyetine de sahip değildir. Ancak, taşıdığı karakterler yönünden hücreyi pozitif hale getirebilir. Bakterinin her bölünmesinde, bu ekzogenot bir kardeş hücrede kalır ve onu pozitif hale sokar. Böylece DNA segmenti replike olmadan, bakterinin her bölünmesinde bir hücre kalmış olur.
İlk başlangıçta, bu ekzogenotu taşıyan ve fakat sonra, hücre bölünmesi sonu, diğer hücrede kalması nedeniyle sonradan bunu kaybeden bir bakterideki enzimler, bölünmeler de giderek azalır ve kaybolur (şekil 2.3.3.1’de). O zaman hücreler, bu enzimleri ihtiva etmediğinden negatif hale dönüşürler (ARDA,2000).



Şekil 2.3.3.1 Abortif transdüksiyon (ARDA,2000).


Son zamanlarda, bu yöntem, insan doku kültürleri için de kullanılmaya başlanmıştır. İnsanların çoğu, bir amino asit olan arjinini yıkmak için karaciğerden salgılanan arjinaz enzimini sentezleten başat bir gene sahiptir. Çekinik homozigot durumlarda enzim salgılanması yoktur; bu bireylerde "A r g i n i n e m i a" denen bir hastalık meydana gelir. Arjininin miktarı kanda artar. Sonuçta zeka geriliği, sara hastalığı ve erken ölüm ortaya çıkar. Shope Papilloma denen bir virüs genellikle tavşanlarda hastalık yapar; fakat insanlarda lizojenik durumda yaşar. Bu virüsle tavşanlardan insana gen taşınması yapılabileceği düşünülmüş ve doku kültürlerinde denemelere girişilmiştir. Normal bir bireyden alınan hücreler bu virüsle enfekte edilmiştir. Daha sonra bu doku kültüründeki virüsler arjininemia olan kişiden alınan hücrelere taşınmıştır. Hücrelerin bir kısmı bu enzimi sentezleyecek yeteneği kazanmıştır. Daha sonraki aşamada, bu virüsler arjininemialı bir kişinin karaciğerine aşılanmıştır. Karaciğerlerine enjekte edilen bu virüsler istenen sonucu vermemişler ve düzelme meydana gelmemiştir. Fakat ileride daha gelişmiş bir teknikle bu aşılamanın yapılabileceği ümidi yitirilmemiştir.
Bir türden diğer türe bu virüslerle gen aktarımı yapmak da mümkündür. Bazı insanlar, süt içerisinde bulunan laktozun bir türevini, yani galaktozu, yıkan enzimden yoksundurlar. Bu insanlar “Galaktozemia" denen bir hastalığa tutulurlar ve kanlarında aşırı galaktoz birikir. Bu hastalar süt ve sütten yapılmış gıdaları almazlarsa normal bir yaşam sürdürebilirler. Fakat eğer bir gen aktarımı yapılırsa bu besinleri de alabilme olanağına kavuşurlar. İnsan bağırsağında yaygın olarak bulunan Escherichia coli, bu enzim için bir gene sahiptir. Hem bu bakteriyi hem de insanı enfekte eden ortak bir virüs vardır. Bu bakteri kültüründen alınan virüsler galaktozemi gösteren bir insandan alınmış doku kültürüne bulaştırılmıştır. Daha sonra yapılan testlerde; bulaştırılan insan hücrelerinin eksik olan enzimi ürettikleri saptanmıştır. Bu yeteneği kazanan hücreler alındığı kişinin karaciğerine tekrar enjekte edilmiş ve orada eksik olan enzimi üretmeye devam etmişlerdir (DEMİRSOY).



3. KAYNAKLAR


AKMAN, M.1983. Bakteri Genetiği. Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi. Yayın No:8. Sivas
ARDA, M. 2000. Temel mikrobiyoloji. Medisan Yayın Serisi No:46. Ankara
ÇON, A.H. 2006. Biyoteknoloji Ders Notları. Denizli
DEMİRSOY, A. http://www.genetikbilimi.com/genbilim/genmuhendis.htm
KILIÇTURGAY, K. , GÖKIRMAK, F. , TÖRE, O. , GÖRAL, G. ve HELVACI, S. 1992. Temel Mikrobiyoloji ve Parazitoloji
ÖNER, C. (Çevirmen) 2002. Genetik Kavramlar. Palme Yayıncılık. Ankara. William S. Klug, New Jersey Koleji ve Michael R. Cummings, Illinois Üniversitesi-Chicago.
ÖNER, M. 1996. Genel Mikrobiyoloji. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi, Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı. Ege Üniversitesi Basımevi Bornova-İzmir. Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Kitaplar Serisi No:94