1. AMAÇ

1.1. Bir su kütlesinin kalitesini değerlendirilmesinde önemli bir faktör olan, sıcakkanlı hayvan bağırsağında yaşayan E. Coli türü bakterilerinin neden olduğu, insan sağlını için tehlike oluşturan, fekal kirliliğin varlığının ve derecesinin saptanmasıdır.

1.2. Arıtma veya dağıtmadaki bir arızanın göstergesi olan insan ve hayvan bağırsağında, toprak içerisinde ve tatlı su yüzeyinde yaşayan koliform bakterilerinin tespit edilmesidir.

2. KAPSAM
Bu deney, insanların tüketimine sunulan suda E.coli ve koliform bakterilerinin tayinini kapsar.

3.** TANIMLAR
E. coli : Eterobacteriaceae ailesinden olan Escherichia coli**beta-galaktosidaz ve beta-glukorinidaz enzimlerinin varlığıyla karakterizedir. Uygun besiyerinde 44-45 ºC’ de ürer, laktozu ve mannitolü fermente ederek asit ve gaz üretir ve triptofandan indol üretir. Bununla birlikte bazı suşları 37 ºC’ de üreyebilirken 44-45 ºC’ de üreyemezler ve gaz üretemezler. E.coli oksidaz üretmez ve üreyi hidrolize etmez. İnsan ve hayvan dışkısında fazla miktarda bulunur; taze dışkının 1 gramında 10,000,000,000 adet bulunabilir. Herhangi bir şekilde fekal kontaminasyona maruz kalmış atık su, doğal sular ve toprak gibi kaynaklarda bulunabilir. Yapılan analizlerde suda E.coli veya termotoleran bakteri saptanması o suda fekal kontaminasyon olduğunu ve/veya yapılan arıtma işlemlerinin yetersiz olduğunu gösterir.

Koliform bakteriler: Koliform organizma terimi; safra asitlerinin varlığında üreme yeteneğine ve 35-37 ºC’ de 24-48 saatte laktozu fermente ederek asit, gaz ve aldehit üretme yeteneğine sahip, gram-negatif, çubuk şeklindeki sporsuz bakterileri belirtmek için kullanılmaktadır. Bu bakteriler aynı zamanda oksidaz negatiftirler ve beta-galaktosidaz aktivitesi gösterirler.Arıtılmış suda koliform bakteri bulunmamalıdır; eğer bulunursa arıtma işleminin yetersiz veya etkisiz olduğu, arıtma sonrası kontaminasyon olduğu veya su içerisinde aşırı miktarda besin maddesi bulunduğu düşünülür. Dolayısıyla koliform testi; arıtma işleminin yeterliliğini ve su dağıtım şebekesinin bütünlüğünü ortaya koymada etkili bir göstergedir. Koliform organizmalar her zaman fekal kontaminasyonu veya sudaki patojenlerin varlığını göstermemekle birlikte, koliform testi halen arıtılmış içme sularının mikrobiyolojik kalitesini ortaya koymada son derece faydalı bir yöntemdir. Eğer elde edilen sonuçlarda herhangi bir karışıklı veya şüphe varsa, özellikle de E.coli ve termotoleran koliformların saptanmadığı durumlarda koliform organizmalar saptanmışsa doğal kaynaklı bir kontaminasyonu incelemeye yönelik özel analizler gerçekleştirilmelidir. Aynı zamanda hijyenik durumu ortaya koymaya yönelik çalışmalar yapılmalıdır.**

4.** UYGULAMA
Bu deney, özellikle dezenfekte edilmiş sular ve bakteri sayısı düşük diğer sular için uygundur.

Kullanılan Malzemeler
• Otoklav
• Su banyosu ve/veya inkübatör
• pH metre
• Membran süzme donanımı
• Membran süzgeçler
• Uçları yuvarlak pensler
• UV lambası
• Süzgeç pedleri

4.1. PRENSİP****

4.1.1. Standart deney, hacmi bilinen bir su kütlesinin membran süzme işleminden sonra ayırd edici bir agar besiyerinde kültür yapılarak belirli şartlar altında inkübe edilip, numunedeki hedef mikroorganizmaların sayısının hesaplanmasına dayanır.

4.1.2.** Hızlı deney, membran süzme işleminden sonra seçici şartlar altında kültür yapılmasına ve numunedeki E.coli sayısının hesaplanmasına dayanır.

4.2.** YÖNTEM******
******** Yöntemin genel tanımı
Yöntem, paralel olarak çalışılabilen referans standart deney ve isteğe bağlı hızlı deney olmak üzere iki kısımdan oluşur ve membran süme tekniğine dayanır. Standart deney, 2-3 gün içerisinde E.coli ve koliform bakterilerin tayin edilmesi ve sayılmasına imkan sağlayan membran ın seçici besiyeri üzerine inkübasyonu ile ardından ileri biyokimyasal özellik olarak tipik laktoz pozitif kolonilerin gelişmesini ihtiva eder. Hızlı deney (21±3) saatte E.coli ‘nin tayinine ve sayımına izin veren iki inkübasyon basamağından oluşur. Standart deney ve hızlı deneyin her ikisi de paralel şekilde yürütülürse, E.coli için nihai sonuç olarak bu iki deneyin sonuçlarından değeri yüksek olanı alınır.



Numunenin hazırlanması
Numunenin hazırlanması numune hazırlama talimatına uygun olarak yapılmalıdır. Deneye tercihen numune alınmasından hemen sonra başlanmalıdır. Numuneler besiyeri sıcaklığında (karanlıkta, 25 ºC’ yi aşmayan sıcaklıkta) korunursa numune alındıktan sonra 6 saat içerisinde deneye başlamalıdır. Olağanüstü şartlar altında numuneler, deneyden 24 saat öncesine kadar 5±3 ºC’ de korunabilir.

Süzme
Çalışılacak numunenin 100 ml.’ si (veya daha fazla hacimlerde, örneğin şişelenmiş su için 250 ml.) bir membran süzgeç kullanılarak süzülür. Membran süzgeç, adı geçen agar besiyerleri üzerine, süzgeç ile agar besiyeri arasında hava kalmadığından emin olacak şekilde yerleştirilir.

İnkübasyon ve ayırma (Standart deney)
Süzme işleminden sonra membran süzgeç laktoz TTC agar plağı üzerine yerleştirilir ve (36±2) ºC’ de (21±3) saat inkübe edilir.

NOT 1: İnkübasyon süresinin 44±4 saat uzatılması deneyin hassasiyetini arttırabilir ve özellikle (21±3) saat sonunda tipik koloniler görülmeyen plaklar için faydalıdır.

NOT 2: 44 ºC’ de inkübasyon için ilave bir membran süzgeç kullanılması, istenmeyen gelişme probleminin üstesinden gelebilir.

Membran süzgeçler incelenir ve membran süzgeç altındaki besiyerine sarı bir renk gelişimi gösteren bütün karakteristik koloniler, boyutlarına bakılmaksızın laktoz pozitif bakteriler olarak sayılır. Oksidaz ve indol deneyleri için tercihen alt kültürlerin hepsi veya sırasıyla triptofan sıvı besiyeri veya seçici olmayan agar üzerinden elde edilen karakteristik kolonilerin temsili bir sayısı (en az on tane) alınır.
Seçici olmayan agar (36±2) ºC’ de (21±2) saat süreyle inkübe edilmeli ve oksidaz deneyi aşağıdaki şekilde yapılmalıdır;

• İki – üç damla taze hazırlanmış oksidaz reaktifi bir süzgeç kağıdı üzerine damlatılır.
• Cam çubuk, tahta çubuk, plastik veya platin (nikel krom olmayan) tel öze ile koloninin bir kısmı hazırlanan süzgeç kağıdı üzerine sürülür.
• 30 saniye içerisinde koyu mavi- mor rengin ortaya çıktığının görülmesi, pozitif reaksiyon olarak kabul edilir.

Tripton sıvı besiyeri bulunan cam tüp (44,0±0,5) ºC’ de (21±3) saat inkübe edilir ve içerisine 0,2 ml. – 0,3 ml. Kovacks reaktifi ilave etmek suretiyle indol üretimi incelenir. Sıvı besiyeri yüzeyinde kiraz kırmızısı bir rengin oluşması indol üretimini doğrular.
Oksidaz negatif reaksiyon veren bütün koloniler koliform bakteri olarak gösterilir.
Oksidaz negatif ve indol pozitif reaksiyon veren bütün koloniler E.coli olarak saylır.

NOT 3: Fekal ve su/toprak kökenli türlerin ayırımı gibi özel durumlarda, koliform bakterilerin teşhisine ihtiyaç duyulabilir.

İnkübasyon ve ayırma (Hızlı deney)
Süzmeden sonra membran süzgeç TSA (Triptofan Soy Agar) besiyeri üzerine yerleştirilir ve (36±2) ºC’ de 4–5 saat inkübe edilir. Daha sonra membran süzgeç TBA besiyeri üzerine yerleştirilir ve (44,0±0,5) ºC’ de 19–20 saat inkübe edilir. İstenirse iki agar besiyeri, ikiye ayrılmış bir plak içerisinde birlikte kullanılabilir. Bu durumda membran süzgeç, taze hazırlanmış TBA (Tripton Bile -safra- Agar) ve TSA’ dan oluşan ikiye ayrılmış plak üzerine yerleştirilir ve (36±2) ºC’ de 4–5 saat, takiben (44,0±0,5) ºC’ de 19–20 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra membran süzgeç, indol reaktifi ile doyurulmuş bir süzgeç yastık üzerine yerleştirilir ve renk gelişimine bağlı olarak 10–30 dakika ultraviyole lambası ile UV ışımasına maruz bırakılır. Membran süzgeç üzerindeki bütün kırmızı koloniler E.coli olarak sayılır.

NOT 1: Ticari olarak bulunan, su bazlı reaktifler UV ışımasına ihtiyaç olmadan hızlı ve kesin sonuçlar verebilir.

NOT 2: Kolonilerin düzensiz dağılımı veya yüksek oranda istenmeyen gelişmenin mevcut olması, yakın kolonilerin renk yayılması nedeniyle indol pozitif kolonilerin ayrımı ve sayımında bozucu etki yapabilir.

Sonuçların Belirlenmesi
Membran süzgeç üzerindeki sayılan karakteristik kolonilerin sayılarından ve yapılan doğrulama deney sonuçlarının dikkate alınmasından sonra numunenin 100 ml. Sinde mevcut E.coli, koliform bakteri ve gerekiyorsa laktoz pozitif bakterilerin sayıları hesaplanır. E.coli tanımlanması için her iki deneyin (Standard deney ve hızlı deney) paralel olarak kullanılması durumunda, nihai sonuç olarak bu iki deneyin sonuçlarından değeri yüksek olanı alınır.